Количественная ПЦР

Количественная ПЦР * колькасная ПЛР * quantitative PCR — полимеразная цепная реакция, дополненная количественной оценкой результатов амплификации с помощью автоматического сканера. Результаты большинства из обсуждавшихся выше методов с использованием ПЦР имеют качественный характер. С помощью этих методов обнаруживают качественныеизменения в генах: точковые мутации, делеции и вставки. Однако при некоторых наследственных заболеваниях соответствующие симптомы возникают в ответ на изменение дозы (числа копий) определенных генов. Типичным примером наследственного заболевания, обусловленного изменением числа копий определенного участка хромосомы 21 в геноме клеток человека, является синдром Дауна. Цитогенетически это заболевание может быть диагностировано по трисомии хромосомы 21 или по наличию крупных транслокаций части этой хромосомы на др. хромосомы на фоне присутствия двух др. нормальных 21-х хромосом. Тем не менее, описаны клинические случаи синдрома Дауна, при которых не происходит видимых изменений кариотипа человека. Это обусловлено дупликацией с последующей транслокацией или без нее небольшого участка хромосомы 21. Выявление таких мутаций невозможно традиционными генетическими (цитогенетическими) методами. Однако с помощью количественной ПЦР определение полуторакратного возрастания дозы соответствующего участка хромосомы 21 становится реальным. Проведение количественной ПЦР характеризуется по крайней мере двумя особенностями. Во-первых, ПЦР проводят в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов или праймеров, меченных с помощью радиоактивной или флуоресцентной метки, с тем чтобы точно определять количество образовавшегося продукта ПЦР. Во-вторых, во время ПЦР необходимо завершать реакцию достаточно рано, пока не образовалось слишком много ПЦР-продуктов. Это связано с тем, что в конечной фазе насыщения, когда продуктов ПЦР становится слишком много, лимитирующими звеньями реакции становятся как субстраты (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты), так и сам фермент, для молекул которого становится слишком много матричной ДНК в виде ПЦР-продуктов. В таких условиях завершение очередного цикла ПЦР уже не сопровождается удвоением количества ПЦР-продуктов и происходит нивелирование небольших количественных различий между разными пробами, которые достаточно четко выявляются на ранних ПЦР после прохождения нескольких циклов реакции. При проведении количественной ПЦР в реакционную смесь необходимо вводить внутренние контроли в виде дополнительной пары праймеров, с помощью которых происходит амплификация генетического локуса, для которого точно известна его доза (число копий на молекулу геномной ДНК) в исследуемом геноме. Т. обр., сравнение количества продукта ПЦР, образующегося при амплификации исследуемого локуса, с количеством продукта ПЦР контрольного локуса позволяет определять их количественные соотношения в геноме.